熒光PCR法檢測試劑盒是一種基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術的分子生物學檢測工具，其核心在于利用序列特異性的熒光標記探針來實現(xiàn)對靶標核酸的高特異性擴增與實時檢測。該試劑盒通常包含熱啟動DNA聚合酶、引物、熒光探針、dNTPs及優(yōu)化緩沖液等組分。
使用熒光PCR檢測試劑盒，核心在于嚴格分區(qū)操作、精準配制反應體系并規(guī)范上機擴增。以下是關鍵步驟和注意事項：
1.實驗前準備
分區(qū)操作：實驗室應分為試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。使用實時熒光PCR儀時，擴增區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)可合并。
試劑解凍：從-20℃冰箱取出試劑盒，室溫解凍約15分鐘。振蕩混勻5秒，離心5秒使管壁液體集中。
2.樣本處理與核酸提取
樣本處理：將病毒采樣管在旋渦混合儀上震蕩5秒混勻。推薦使用磁珠法提取核酸，加入200μL樣本至提取板，20-30分鐘后獲得50-100μL核酸。
核酸保存：提取后若不立即檢測，可暫存于-20℃或-70℃，避免反復凍融。
3.反應體系配制
分裝體系：準備標記好的A、B、C管，按比例配制反應液。振蕩混勻10秒，瞬時離心5秒。
加樣：使用八聯(lián)管分裝，每孔20μL。取5μL核酸分別加入A、B、C體系，并加入陰陽性對照。蓋緊管蓋后瞬時離心，檢查液面高度是否均一。
4.上機擴增
儀器設置：打開儀器軟件。將配制好的試劑和對照品傳遞至擴增區(qū)。
擴增程序：通常包括逆轉錄（如45℃ 10分鐘）、預變性（如95℃ 5分鐘）和循環(huán)擴增（如95℃ 15秒，60℃ 60秒，40個循環(huán)）。
5.結果分析
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更新時間：2025-12-11
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